专访祁峰丨大肠杆菌内实现四氢生物喋呤自给自足和血清素生产
2021 年的网络用语中，emo 一词可谓火遍全网。这一网络用语被大家用来形容各种负面情绪，比如抑郁、不开心、悲伤、失落和不如意等，带着“三分戏谑、五分自嘲和两分无奈”。事实上，根据世卫组织 2021 年发布的数据，世界上大约有 2.8 亿人患有抑郁症。据流行病学调查，中国抑郁症终生患病率为 6.8%，目前我国患抑郁症人数近 1 亿左右。
这一庞大的数字不得不引起公众的重视，血清素（即 5-羟色胺）作为一种能产生愉悦情绪的信使也受到了关注，它是一种抑制性神经递质，在临床和制药领域具有较多应用，如调控情绪、管理行为、维持睡眠周期和清除体内有害自由基等。它几乎影响大脑活动的每一个方面：从调节情绪、精力、记忆力到塑造人生观，如抗抑郁症药盐酸氟西汀就是通过提高脑内 5-羟色胺水平而起作用的。
血清素在体外可由其前体 5-羟基色氨酸（5-HTP）经过一步转化获得，5-HTP 的主要来源依靠植物组织提取。目前，已知加纳谷物的种子中 5-HTP 含量很高，因此该植物是目前市场上主要的 5-HTP 的来源，但是栽培的地域限制以及原材料的不足严重影响了 5-HTP 的工业化生产，进而影响了通过这种方法获得的血清素产量。近年来，随着现代合成生物学的飞速发展，利用代谢工程改造过的大肠杆菌作为细胞工厂生产血清素的方法逐渐被若干科研人员所实践。
（来源：Pixabay）
近日，福建师范大学祁峰教授团队在 ACS Synthetic Biology 上发表了以“Engineering Metabolic Pathways for Cofactor Self-Sufficiency and Serotonin Production in Escherichia coli”的研究论文，证实了使用大肠杆菌生产高水平血清素的前景。
借此机会，生辉 SynBio 邀请到了福建师范大学的祁峰教授来与我们分享他的研究内容及进展。
祁峰于 2011 年博士毕业于北京理工大学，师承我国著名合成生物学专家李春教授；2012 年在清华大学化学工程系应用化学研究所从事博士后研究期间接触合成生物学领域至今；2017-2018 年美国莱斯大学（Rice University）访问学者，合作导师为 George N. Bennett 教授；现为福建师范大学生命科学学院教授，研究方向为微生物合成生物学和生物能源等。
福建师范大学是福建省与教育部共建高校、福建省重点建设高校。目前祁峰的课题组所在实验室是福建师范大学“工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心”，包括 1 个教育部级科研平台（工业微生物教育部工程研究中心）和 2 个省级科研平台（“福建省现代食品发酵技术工程研究中心”和“福建省工业微生物高通量选育保藏平台”）。
在大肠杆菌内实现四氢生物喋呤自给自足和血清素生产
前期，祁峰团队所做的工作主要是以葡萄糖或甘油为碳源从头合成血清素，或通过全细胞催化的手段，以 L-色氨酸作底物经羟化和脱羧两步反应合成血清素。
然而，胞内 L-色氨酸作底物的羟化反应需要较多的重要辅因子四氢生物喋呤（BH4）的存在，此前，也有报道将外源 BH4 循环途径导入细胞促进强化反应的研究，但是由于 BH4 内源产量不足导致 5-HTP 和血清素产量很低。
在这篇文章中，祁峰团队首先优化了异源血清素合成途径中的两个关键酶即色氨酸羟化酶和脱羧酶，然后将 BH4 的生物合成和再生模块相结合导入大肠杆菌基因组中，通过进一步的代谢工程改造，包括增强 BH4 前体 GTP 的生物合成和提高胞内还原性辅因子 NADH/NADPH 的可用性以确保充足的内源性 BH4 的供应。使用优化的分批补料发酵，实现了 40.3%（mol/mol）的总体最大血清素产量和 1.68g/L 的峰值滴度（产率为 0.016g/L/h）。该研究采用的策略显示了使用大肠杆菌进行四氢生物喋呤自给自足和高水平血清素生产的前景，展示了工程菌株在工业应用中的潜力。
（来源：ACS Synthetic Biology）
祁峰也透露，大肠杆菌作为细胞工厂，也存在普遍的缺陷，例如质粒丢失导致后期发酵时产量不稳定和菌株安全性等。因此，团队也正尝试以其他细胞工厂为底盘细胞合成血清素及其他氨基酸衍生化合物。
除了血清素，祁峰课题组利用原核微生物如大肠杆菌和类球红细菌等底盘细胞所做的工作包括利用大肠杆菌细胞工厂高产芳香族氨基酸（如色氨酸和苯丙氨酸）及其衍生物（如生长素、5-羟基色氨酸、5-羟色胺和褪黑素等）；利用类球红细菌高产辅酶 Q(10) 和法尼醇等萜烯类化合物，目前高产辅酶 Q(10) 的类球红细菌已经实现工业化应用，与福建省内两家公司形成了战略合作。芳香族氨基酸类衍生物产品正在进一步完善产业化研究。另外，祁峰实验室还有真核微生物如破囊壶菌和圆红冬孢酵母，主要利用破囊壶菌细胞工厂生产 DHA ，以及改造圆红冬孢酵母生产微生物油脂和类胡萝卜素类产品。
生物能源：木质纤维素的综合利用
除了微生物代谢工程，祁峰在生物能源方面也有一些涉猎，而具体接触这一研究项目还要追溯到其博士后。“2011-2014 年期间，国际油价高涨，我所在的研究小组主要是以动植物油脂或废弃油脂（地沟油）为原料，由甲醇或乙醇在催化剂作用下经酯交换或酯化反应制成脂肪酸甲（乙）酯即生物柴油。生物柴油为国际公认的可再生清洁能源，主要用于动力燃料和生物基材料领域。后来由于石油价格回调，我们将主要研究方向聚焦在利用产油脂微生物生产高附加值食用或饲料添加剂油脂等研究领域。”
就生物能源领域而言，祁峰团队目前仍关注的是木质纤维素的综合利用。木质纤维素是自然界中最为丰富的有机物。据估计，植物每年通过光合作用产生的干物质高达 1500-2000 亿吨，是地球上唯一可超大规模再生的实物性资源。我国每年产生的农业作物秸秆有 7 亿多吨，相当于 3.5 亿吨标准煤，森林采伐加工剩余物 1000 多万吨，蔗渣 400 多万吨，但每年用于工业过程或燃烧的纤维素资源仅占 2% 左右，绝大部分还未被利用。
近几十年由于化石资源短缺日趋严峻和环境污染日益严重，以来源广泛且可再生的木质纤维素为原料制造生物能源和工业化学品受到了世界各国的广泛关注。其中以生物技术为核心的木质纤维素的生物转化已经成为生物能源开发、生物质资源加工和绿色化工过程的关键技术之一，相关研究也已成为当前工业微生物技术的一个热点和难点。
祁峰表示，目前木质纤维素作为生物能源利用的难点在于木质素的降解和综合利用。在我国“缺油少气”的能源结构下和“双碳”战略上升到国家层面之后，我国生物质能源的利用和发展前景非常好，举例来说比如生物质发电空间巨大，可以有力缓解我国用电压力。结合生物能源与碳捕获和储存技术（BECCS），生物质能源能将创造负碳排放，并在各个领域为我国作出巨大的减排贡献。
▲图丨生物质发电厂（来源：oschatz）
“合成生物学技术的发展为生物能源领域开拓了新的实现和应用途径”
“不过，生物能源目前的确还不算是一个成熟的产业，但是生物能源作为一种可持续性能源形式，是最有望替代传统能源、能大规模开发、有利于保护环境和解决能源危机的，同时也可以带动其他新兴生物能源产业的发展。”
生物能源的开发利用是我国能源可持续发展规划的重要内容，同时也是我国 21 世纪能源发展战略的重要方向。进入 21 世纪以来，受气候变化加剧、农产品结构性过剩以及地区冲突牵制石油供应等多重因素影响，全球生物能源产业发展明显加速。2018 年全球生物燃料乙醇产销量约 8000 万吨，生物柴油产销量近 4000 万吨，生物质能源发电装机累计容量达到 3.7×10(10)W，以生物质为燃料的热电联产甚至成为一些国家的主要发电和供热手段。
祁峰此前曾与国家电网新能源部门有所接触和合作，他表示，以生物质为燃料的热电联产当然还是以木质纤维素直接燃烧来实现。然而，对于生物柴油和燃料乙醇，如果能够充分利用存量巨大的木质纤维素为供应链，其成本和产能将会有极大的提升。但是木质纤维素作为生物能源有效利用的困难仍然在于木质素的降解分离和低成本处理及综合利用，若能完全解决这些问题，很大程度上会打通利用生物能源的供应链，而合成生物学技术的发展为生物能源领域开拓了新的实现和应用途径。
采访的最后，祁峰也对各类生物能源以及合成生物学在其中的应用发表了自己的看法：
1）生物柴油
生物柴油是指通过生化手段从水生植物、油料作物和动物油脂等生物能资源转化而来的高脂酸甲烷，可用以替代传统柴油。生物柴油相对于传统柴油具有抗爆性强、十六烷值高、点火性优、流动性好、安全性高等特点，且不含芳香烃类等致癌类有害成分。生物柴油的能量消耗量占传统柴油的 25%，可实现低污染和低排放，是优质的绿色能源，其生物降解率高达 98%，为传统柴油的 2 倍。在传统柴油中加入约 20% 的生物柴油后，硫化物和碳氧化物的排放量可分别降低 70% 和 13%。现在的生物能源产品以利用转基因大豆油、菜籽油与蓖麻油等植物油生产的生物柴油居多，可广泛推广使用。目前利用合成生物学策略，使一些产油微生物如酵母和大肠杆菌等生产生物柴油，能够避免使用植物和动物油脂，真正做到“不与人争粮，不与粮争地”。国际著名的合成生物学公司 Amyris 就曾经在早期布局过生物柴油项目。
2）生物乙醇
生物乙醇可用于优质油品的品质改良，其来源于植物，是酒精的加工产物。生物乙醇的使用旨在调和我国油品的高辛烷值，进一步提高我国的油品的品质，其不仅具有与酒精相同的功能特征，而且比甲基叔丁基醚的增氧效果高 1 倍以上。现存油品改良剂主要有甲基叔丁基醚、生物乙醇和乙基叔丁基醚三种，生物乙醇改良剂在我国已推广使用，收到显著效果。现阶段利用合成生物学技术强化酿酒酵母生产生物乙醇取得了显著进展，为国内生物质乙醇生产企业如河南天冠、安徽丰原和黑龙江华润等提供了可靠的技术保障。以河南天冠为例，30 万吨燃料乙醇项目建成后，年消化陈化小麦 105 万吨，可解决 330 万亩小麦的销售问题，实现农业销售收入 11 亿元，减少财政补贴 2 亿多元，可实现农民增收、财政减补、企业增效的多重经济效果，对稳定和调控粮食价格、促进农业产业化具有显著的拉动作用。
3）生物制氢
生物制氢是利用厌氧细菌或光合细菌，利用碳水化合物供氢体所制备的氢气。生物制氢以糖、淀粉、豆品、酿酒和麦乳制品等的加工废水，以及麸皮、糟渣类、秸秆等农业废弃物为原料。生物制氢不仅可满足生产和日常生活所需的氢气来源，还可实现废物的重新回收利用。通过对产氢气细菌的合成生物学改造使其具有厌氧或好氧条件下利用生物质制备氢气的能力。目前壳牌石油（Shell）和波音公司都在关注和投资生物制氢这一领域。